綜合編譯：John Xie

　　生物療法的概覽

　　過去幾十年來，藥物開發(fā)領域發(fā)生了重大變化，尤其是在大分子生物治療領域。在不斷增長的市場中，生物治療藥物的治療特異性帶來了許多模式選擇。與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，大分子藥物除了具有精確的靶向能力外，還有可能帶來更高的經(jīng)濟回報。借鑒生物療法的成功經(jīng)驗，生物仿制藥也正在被開發(fā)為具有成本效益的替代品，以取代價格高昂的第一代藥物。

　　對于大分子藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，技術的重點是推進價值鏈的上游和下游階段。對藥物設計上游關鍵因素的關注，使公司能夠預測和預防可能導致藥物審批延誤或代價高昂的召回的下游問題。從單克隆抗體到雙特異性抗體和多特異性抗體，再到納米抗體和重組蛋白，生物治療的重要性在各種類型中不斷擴大。每種方式都提供了多種預防或治療疾病的選擇，如風濕病、癌癥、糖尿病、貧血、傳染病等。

　　細胞系開發(fā)，曲折的歷程

　　生物治療藥物開發(fā)的上游工作流程在細胞系開發(fā)（cell linedevelopment，CLD）、克隆選擇、放大、自動化和數(shù)字化方面取得了重大進展，從而提高了精確度和生產(chǎn)率。生物治療價值鏈上的這些變革性進步也有助于提高靈活性和監(jiān)管合規(guī)性。新冠疫情加快了將藥物推向市場的進程，同時還能保持較高的質量、安全性和有效性標準。從 COVID-19 的經(jīng)驗中，作為科學家和創(chuàng)新者，我們了解到疫苗、小分子和大分子藥物以及相關生物治療藥物的開發(fā)需要藥物開發(fā)商、技術提供商、供應鏈組織和監(jiān)管機構在全球范圍內(nèi)開展更多合作。

　　CHO 細胞系被廣泛用于生產(chǎn)治療性蛋白質，而最近通過基因編輯等新一代技術對 CHO 細胞進行工程改造的進展，使基因敲除細胞系的特性得到了增強。使用 CRISPR/Cas9 的基因組編輯系統(tǒng)通過 CRISPR 系統(tǒng)介導的雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB），在基因組的特定位點進行調控或基因敲除、基因敲入或整合感興趣基因（gene-of-interest，GOI），在了解基因功能方面發(fā)揮了強大的作用。

　　在大分子生產(chǎn)的上游階段，CLD 是一個漫長、耗時的過程，而且由于克隆的不穩(wěn)定性和相關蛋白的可接受表達水平，CLD仍然具有挑戰(zhàn)性。

　　產(chǎn)品變異性可在 CLD 過程的不同階段產(chǎn)生，包括但不限于轉染過程中的變異性、宿主細胞中基因整合的隨機性（可導致克隆異質性）以及轉基因的不穩(wěn)定性和/或沉默。因此，穩(wěn)定的克隆細胞庫被用于 GMP 生產(chǎn)，以盡量減少最終產(chǎn)品的變異性。然而，隨著目前的臨床競賽，越來越多的研究小組正努力在生產(chǎn)過程的早期實現(xiàn)產(chǎn)品質量的均一性，從而使臨床前研究能夠使用在 CLD 早期階段生產(chǎn)的材料（即細胞池）。

　　基于轉座子的技術

　　為了克服上述限制，人們利用稱為轉座子（transposons）的遺傳元件作為載體，將 GOI 植入宿主基因組。轉座子系統(tǒng)（ 如Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac 和 Tol2）優(yōu)先將 GOI 整合到活躍的轉錄位點上，使細胞系得以快速發(fā)展，并產(chǎn)生高滴度的重組蛋白。因此，轉座子是將 GOI 運送到基因組中的理想載體。

　　DNA 轉座子由轉座酶基因和倒位末端重復序列（inverted terminal repeat，ITR）組成。轉座酶的活性和轉座子片段插入基因組位點是通過“剪切- 粘貼“機制進行的。利用轉座子傳遞重組基因的基本載體設計包括 GOI 和選擇標記，兩側是 ITR，轉座子上的轉座酶基因位于單獨的載體上。不過，為了控制轉座酶基因的活性，從而控制基因貨物的流動性，轉座酶通常以 mRNA 的形式提供。使用基于轉座子的載體實際上消除了轉座子載體骨架上存在的細菌元件整合的風險，因為轉基因的整合是由轉座酶催化的，它能特異性地識別 GOI 和選擇盒側翼的ITR。此外，這種表達系統(tǒng)提高了不同轉染之間的可重復性，從而提高了克隆的穩(wěn)定性。

　　基于轉座子的技術和成熟的 CHO 細胞系已被采用于 CLD 和大分子表達工作流程中?；谵D座子的表達系統(tǒng)可實現(xiàn)多拷貝、非片段化基因盒整合。這種轉座子方法可使基因和表型水平上的克隆穩(wěn)定性大于 95%，最大限度地減少了克隆篩選工作，從而簡化了工藝開發(fā)并簡化了規(guī)模化生產(chǎn)。

　　這種技術通常由兩部分組成，即轉座子載體和轉座酶（最好是 mRNA 形式），兩者可共同轉染到 CHO 細胞系中。mRNA 翻譯后，產(chǎn)生的轉座酶催化轉基因切除并整合到細胞系基因組中。與隨機整合表達載體相比，轉座子系統(tǒng)的一個優(yōu)點是它允許表達盒在每個整合位點完整整合（圖 1），因此不會出現(xiàn)任何片段化（圖 2B）、重排（圖 2C）或并合（圖2D）。因此，將 GOI 定向整合到細胞系基因組內(nèi)的轉錄活性位點，可使細胞系的同質性和克隆穩(wěn)定性超過 95%。

　　未來展望

　　在過去的幾十年中，大分子藥物開發(fā)在上游和下游階段都取得了進展，包括簡化流程、建立關鍵質量屬性 (CriticalQuality Attributes，CQA)、合規(guī)要求以及支持工作流程的技術。從生物學和技術角度來看，生產(chǎn)大分子藥物的上游細胞系開發(fā)是一個關鍵和奠基性的步驟，它不僅有助于提高產(chǎn)品滴度產(chǎn)量和擴大規(guī)模，而且還確定了消除細胞偽影和最終純化藥物所需的技術。

　　如上所述，CHO 細胞系長期以來一直被廣泛用于蛋白質藥物的表達和生產(chǎn)。最近的基因編輯和 GOI 運送載體以及相關機制實現(xiàn)了有針對性的、一致的細胞系工程。

　　轉座子技術提供了特定的啟動平臺，簡化了開發(fā)過程，減少了生產(chǎn)工作量。通過自動細胞評估技術實現(xiàn)細胞計數(shù)和克隆選擇方法的進一步發(fā)展和標準化，將進一步簡化細胞培養(yǎng)過程中的端到端工作流程。將流程和協(xié)議與自動化、檢測和細胞成像技術以及數(shù)據(jù)分析和管理相結合，將重新定義上游細胞系開發(fā)的流程。機器學習將進一步促進先進的預測和數(shù)據(jù)模型，以建立最佳實踐并消除流程差距。跨各種功能和流程領域的組合協(xié)作方法將促成下一代生物制劑模型的精確性、可靠性和有效性。

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