新冠肺炎疫情的大流行使免疫學成為國際關注的焦點。該領域的研究人員一直在研究免疫系統(tǒng)對SARSCoV- 2 病毒的反應，以了解人的身體是如何抵抗病毒感染的。免疫學檢測的進步尤其依賴于一種儀器，流式細胞儀。

　　“流式細胞儀對我們了解傳染病很重要，”William Telford 表示，他是美國國家癌癥研究所流式細胞儀核心設施的負責人之一。 納米級流式細胞儀可以被用來描述 SARS-CoV-2 和其他病毒中發(fā)生的免疫變化。

　　William Telford 談到：“免疫細胞在顯微鏡下看起來非常相似。只有當?shù)鞍踪|在其表面顯露才能反映出更多的信息，比如T 細胞還是B 細胞；激活還是滅活；疾病特異性還是非特異性等。我們正在發(fā)現(xiàn)越來越多的免疫細胞標志物。”Kinetic River 總裁兼創(chuàng)始人Giacomo Vacca 對 William Telford 關于COVID-19 和免疫學影響的看法表示贊同。他談到，“在免疫學等領域，我們看到應用推動了對更好工具的需求。

　　像大多數(shù)生物醫(yī)學工具一樣，流式細胞儀是一種復雜的儀器，它依賴于包括流體力學、計算機科學以及光學和光子學在內(nèi)的多學科融合。在典型的應用中，樣本（例如異質細胞群）被熒光標記的抗體標記，然后注入微流體腔室，在該腔室中通過激光束激發(fā)熒光團，檢測器記錄發(fā)射和散射的光，并將結果發(fā)送到計算機進行分析。

　　雖然這項技術可以追溯到20 世紀50 年代，但目前設備的使用情況，已經(jīng)完全看不到其原始樣機的影子。一些最先進的設備要包含多達10 個激光器，它們可以發(fā)出不同波長的光束。William Telford 說：“我們已經(jīng)看到技術的根本變化將繼續(xù)影響該領域。” 在過去三十多年，他一直是該技術領域的研究人員和專家，他的設施為許多與美國國家癌癥研究所合作的學術和臨床研究人員提供了支持。

　　越來越多的標簽

　　在過去十年，William Telford 見證了研究人員用來定義細胞群體的細胞表面標記物和熒光探針數(shù)量翻了一番。他說：“我們最多可以使用商業(yè)儀器對40 色熒光參數(shù)進行標記。我們正在利用各種各樣的可見激光波長。”

　　Giacomo Vacca 說，這些參數(shù)的數(shù)量是很重要的，因為它們可以讓科學家精確地描述看似相似的細胞群。然而，標簽數(shù)量的增加也帶來了潛在的挑戰(zhàn)。熒光團的光譜尾很長，導致其發(fā)射物從一個檢測通道溢出到另一個檢測通道。因此，研究人員需要合適的激光器、檢測器和計算算法，以區(qū)分重疊信號。Giacomo Vacca 補充說：“添加的標簽越多，補償問題就越復雜。

　　流式細胞儀和儀器制造商已經(jīng)設計出增加研究人員可用標簽數(shù)量的方法，而不必依賴諸如色彩補償之類的數(shù)學過程，色彩補償是用于區(qū)分光譜重疊。William Telford 說，一種方法是將標簽推到可見光范圍之外并進入紫外線。 Giacomo Vacca 同意這種方法：“在1990 年代后期將固態(tài) 355nm 激光器商業(yè)化引入之后，提供激發(fā)波長的流式細胞儀開始緩慢增長。化學家據(jù)此開發(fā)出了熒光團。”

　　William Telford 的實驗室和其他實驗室正在使用空間分離的連續(xù)波激光器，來激發(fā)可見光和紫外區(qū)域的熒光團。他談到，探測技術也很重要，其研究團隊已經(jīng)開始使用電子崩光電二極管陣列來捕捉熒光信號，而不是傳統(tǒng)的光電倍增管。

　　William Telford 表示，另一項獲得關注的發(fā)展是光譜流式細胞儀。這種技術是迭代使用CCD 進行檢測，它捕獲每個激發(fā)熒光團的全光譜，而不是特定的發(fā)射波長。這樣可以更好地區(qū)分標簽。他認為10 年內(nèi)光譜技術將成為主導技術。

　　Kinetic River 公司的Giacomo Vacca 則采取了不同的方法。為了補償光譜重疊，該公司制造的流式細胞儀可以計算每個熒光團的熒光持續(xù)時間或壽命，而不僅僅是測量出其發(fā)射波長。然而，為了做到這一點，他們必須從連續(xù)波激光器切換到脈沖激光器。

　　“熒光壽命給了我們一個額外的參數(shù)來區(qū)分光譜相似的分子，”Giacomo Vacca 說，“你可以用多個熒光團標記細胞，例如所有熒光團都在藍色區(qū)域發(fā)出，并通過測量信號衰減來區(qū)分它們。”通過在數(shù)據(jù)分析中添加補償方法，他相信，細胞分析學家可以進一步增加參數(shù)的數(shù)量，超出目前可能的范圍。William Telford 說：“通過觀察，將會發(fā)現(xiàn)一些有趣的生物學應用。”

　　根據(jù)Giacomo Vacca 的說法，測量信號衰減的另一個好處是能夠消除內(nèi)源性熒光團，即自發(fā)熒光的背景。他說： “對所有實驗者來說，這是一件令人討厭的事，越深入紫外線區(qū)域，情況就越糟糕。”

　　激光解決方案

　　William Telford 和Giacomo Vacca 都將流式細胞儀的進展，歸功于在可見光和紫外區(qū)域大量可選用的激光器。“關于流量的好處是，有了改進的光學器件和檢測器，將不再需要大量的激光能量，”William Telford，“我們現(xiàn)在使用的是相對低功率的激光器，因為細胞在光束中的停留時間很短。”

　　硅谷初創(chuàng)企業(yè)

　　歐司朗光電半導體公司的高級應用工程師Ann Russell 回憶稱：當年，流式細胞儀使用的激光器主要是氣體離子工具，像大學宿舍冰箱一樣大。她認為直接傳輸和二極管激光技術的進步有助于減小儀器的尺寸，同時提高其質量。“ 我們的單模激光束非常干凈，它們正是流式細胞儀客戶正在尋找的東西。”她補充說，改進的波導也有助于提高光束質量。

　　Ann Russell 指出，在當今的許多激光器上，研究人員可以通過調節(jié)二極管的溫度，使其波長變化可達15nm。她說： “這就提供了一些額外的選擇，即不必進入紫外線區(qū)域，因為紫外線會引起電離。”經(jīng)濟性和微型化的結合可以將流式細胞儀推向新的領域。在Ann Russell所在的北加利福尼亞州，生物技術初創(chuàng)公司通常會使用該技術。

　　William Telford 也看到了該領域的爆炸式增長。現(xiàn)在有比以往更多的工具和更多的公司。他認為可以執(zhí)行自我分析的小型臺式設備將在改善世界偏遠地區(qū)個人健康方面發(fā)揮作用。例如，在加德滿都的診所不需要將易腐爛的樣品送到印度的一家醫(yī)院。大量使用這些儀器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可能會促進先進計算技術在流式細胞術的使用。“要擁有優(yōu)秀的人工智能，你需要大量的數(shù)據(jù)支撐，”Ann Russell 說，“但我們?nèi)祟惿瞄L生成數(shù)據(jù)。”

　　William Telford 還指出了流式細胞儀數(shù)據(jù)分析改進的趨勢，部分原因是可檢測參數(shù)數(shù)量的增加。他說：“無論是人工智能還是機器學習，我們都開始采用人們一直使用的蛋白質組學和基因組學工具。這將幫助我們更好地可視化復雜的多參數(shù)數(shù)據(jù)，并獲得我們之前無法獲得的結果。”

　　納米流

　　正如流式細胞儀越來越小一樣，它們的靶標也越來越小。 Giacomo Vacca 說：“一個非常重要的研究領域是測量亞微米粒子。”亞微米和納米級流式細胞術已經(jīng)利用了技術改進的融合以及對短波長激光器的推動。

　　John Tilton 是凱斯西儲大學的營養(yǎng)學副教授，他在該大學蛋白質組學和生物信息學中心指導免疫生物學項目。2020 年底，他的實驗室報告使用納米級流式細胞儀分析了感染該病毒的患者中HIV 蛋白酶活性的變異性。他說，這是該技術首次被用于直接測量酶活性，也是首次報道使用納米級流量來觀察患者來源的病毒。

　　John Tilton在使用流式細胞儀方面已有20多年的經(jīng)驗，并且他對確定病毒是否像細胞一樣具有異質性非常感興趣。他說：“當你在教科書中看到病毒圖片時，它們看起來都很完美。但是我們知道他們實際上不是，并且我們想知道是否可以發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的差異。”

　　John Tilton 的小組表達了從感染了HIV 的患者細胞中提取的病毒基因序列，以及一個含有FRET（熒光共振能量轉移）熒光標記對的報告基因構建體，這些熒光標記被HIV 蛋白酶切割位點隔開。研究人員用488nm波長激光刺激了該構建體，并開發(fā)了一種稱為熒光閾值的技術，該技術可識別低水平的熒光，以檢測發(fā)射的變化，這在以前可能會被當作背景排除。只有從病毒序列表達的活性蛋白酶才能有效地裂解該構建體，從而抑制了熒光共振能轉移。 突變酶沒有這種能力。

　　John Tilton 發(fā)現(xiàn)，HIV 蛋白酶活性的異質性反映了這些病毒的傳染性以及它們對蛋白酶抑制劑的耐藥性，蛋白酶抑制劑是HIV 治療的主要形式之一。他進一步指出，由于病毒是如此之小，因此必須針對納米級流式細胞術優(yōu)化激光束寬度以及其他技術問題。但他認為，這項技術將會像細胞分析一樣成為常規(guī)技術。John Tilton 說：“它的靈敏度真是令人難以置信。”他的實驗室正在建造自己的儀器。

　　他說：“就更好地了解病毒和免疫學而言，我認為納米級流式細胞儀發(fā)揮著重要作用。這對基于病毒顆粒的疫苗，基因療法和癌癥的病毒治療具有重要意義。”William Telford 有同樣的見解。他說：“這是一個令人興奮的時刻，因為有很多新的儀器和技術正在開發(fā)中。”

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